四環素是一類水體中常見的廣譜抗生素 ,它能與核蛋白體的30S 亞單位結合,阻止氨酰基tRNA 同核蛋白體結合,抑制蛋白質的合成。同時,四環素類藥物的廣泛使用引起了四環素耐藥特殊結構：莢膜、鞭毛、菌毛在環境中產生并快速傳播。至今,被發現的四環素耐藥細菌有115 屬、530 種。不同來源廢水中四環素的含量差異較大,一般含量在幾十ng?L - 1 到幾百μg?L - 1 之間。近年來,四環素對污水處理系統的影響引起了廣泛關注。CETECIOGLU 等 在SBR 中通過測定COD 的含量和氣體的產量的變化發現,當四環素投加量低于
8. 5 mg?L - 1 時,反應器內底物降解作用不受影響,但產氣量減小了10% ~ 20% ,說明四環素對系統中微生物造成了影響。AYDIN 等在ASBR中通過測定甲烷產量和揮發性脂肪酸的積累量的變化發現,不同濃度組合的四環素、紅霉素和磺胺對同型乙酸菌和產甲烷菌產生了不同程度的影響。AYDIN 等 在隨后的研究中又分別運用了real-time PCR 和PCR-DGGE 分子生物學技術發現,四環素、紅霉素、磺胺3 種抗生素共同影響下產乙酸特殊結構：莢膜、鞭毛、菌毛和產甲烷古菌存在互營關系且這種互營關系對反應器的穩定運行起關鍵作用。
隨著分子生物學技術的發展,高通量測序技術已被廣泛使用在研究土壤、海洋、污水、活性污泥的群落結構中。第2 代Illumina MiSeq 高通量測序能克服傳統檢測方法的缺陷,具有通量高、錯誤率低、成本低、流程自動化、速度快等優勢 ,目前已在研究微生物多樣性群落結構方面受到廣泛認可 ;因此,將Illumina MiSeq 高通量測序方法應用于污水處理系統的研究,對深入認識污水處理系統具有實際意義。
當前,污水厭氧處理因其高效能、低能耗等特點在污水處理工程上開始受到關注。它實際上是借助于不同微生物種群間的協同作用,通過水解―酸化―產甲烷等一系列生物反應將有機底物轉化為甲烷和無機物的過程。在這個過程中,微生物群落構成直接影響到污水處理的效果,因此,深入認識污水厭氧消化系統(system)的微生物群落構成,對厭氧污水處理系統的穩定運行具有指導作用。
基于此,本研究通過室內模擬實驗,選擇(xuanze)ABR 多相厭氧反應器進行連續（Continuity)流實驗,啟動反應器達到穩定狀態后,分別在不含四環素和含有250 μg?L - 1 四環素的人工配制污水條件下運行90 d,通過考察來自反應器的氫氣、甲烷產生量的變化,運用Illumina MiSeq 高通量測序方法對反應器中的微生物群落構成進行分析(Analyse),研究四環素對污水厭氧處理系統微生物群落造成的影響,以期從微生物關系角度（angle)深入了解這種影響,為污水厭氧處理技術研究及工程實踐提供參考。
1 材料和方法
1. 1 實驗裝置
ABR 采用厚為5 mm 的有機玻璃板加工制成,尺寸為455 mm × 150 mm × 400 mm,有效容積為21L,置于℃ 的恒溫箱中。反應器分為3 個格室,按照前后順序分為格室1、格室2、格室3,分別命名為C1、C2、C3,每個格室由上、下流室 組成, 折流板底角為45°。格室體積比V1 ∶ V2 ∶ V3 =
1. 5 ∶ 1 ∶ 1。每個格室上部設有集氣口,側部分別設有取水口、取泥口,實驗裝置見圖1。
1. 2 接種污泥
接種污泥取自廣州市瀝窖污水處理廠A2 / O 工藝的厭氧池。污泥MLSS =
2
4. 67 g?L - 1 ,MLVSS/MLSS = 0. 61,pH =
6. 58,含水率為9
7. 30% 。接種污泥體積為反應器有效容積的1 /3。
1. 3 實驗用水
配水以葡萄糖為碳源,NH4 Cl 和KH2 PO4 分別為氮源和磷源,同時加入C
A、M
G、F
E、C
O、Ni 等微量元素,以保證微生物細胞合成的需要。此外,向配水中投加一定量的NaHCO3 以保證ABR 內的緩沖能力。
反應器以連續流方式進水,水力停留時間為24 h。在啟動階段,采用逐步增加進水負荷的啟動方式,進水COD 濃度為500 ~ 2 000 mg?L - 1 ,當COD 去除率穩定在80% 以上、出水各項指標趨于正常,啟動階段完成。反應器的運行先后經歷了啟動階段、穩定運行階段、添加四環素運行階段。
1. 4 DNA 的提取和PCR 擴增及其微生物多樣性數據分析
分別在反應器的穩定運行階段和添加四環素運行階段每間隔18 d 從每個格室采集一次活性污泥樣本,分別命名為Ctrl D18C1、Ctrl D36C1、Ctrl D54C1、Ctrl D72C1、Ctrl D90C1、Tre D18C1、Tre D36C1、TreD54C1、Tre D72C1、Tre D90C1,其中“Ctrl”代表未添加四環素運行時的污泥樣本,“Tre”代表添加四環素運行時的污泥樣本,“D18”代表第18 天取樣,“C1”代表樣本取自格室1,格室2 和格室3 的樣本命名為C2和C3。實驗共從3 個格室中共采集到30 個活性污泥樣本。分別稱取0. 4 g 污泥用于DNA 提取。采用MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit DNA 提取試劑盒進行DNA 提取,提取步驟依據(yī jù)說明書操作,提取好的DNA 保存于- 20 ℃ 冰箱。
以提取的基因組DNA 作為模板,使用16S rRNA 基因V4 區特異性引物F515 和R806 進行PCR 擴增,擴增片段長度約為300 bp。本實驗采用50 μL 的PCR 反應體系:1 μL 模板,各1 μL 的10 μmol?L - 1正向引物和反向引物,0. 2 μL 20 mg?mL - 1 的蛋白質,25 μL 的GOOGLE PRemix Ex Taq Version,
2
1. 8 μL 滅菌水。PCR 的反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,31 個循環;72 ℃ 10 min。將各樣品的PCR 產物按照等摩爾量進行混合,使用QIAquick Gel Extraction Kit 凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 混合產物,并用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測,最后使用Illumina MiSeq 高通量測序平臺進行基因測序。
測序結束后,首先,使用Trimmomatic 軟件去掉序列3′端連續的低質量堿基。接著,用Mothur 中的“make. contigs”命令將兩端reads 拼接成完整的目的DNA 片段,再用“screen. seqs”,“trim. seqs” 命令進行錯誤序列的識別和修剪。最后,使用QIIME 軟件對測序數據進行微生物的多樣性分析,將得到的序列進行聚類,將97% 相似性的序列聚類成為OTUs 。物種分類由UCLUST 軟件 和Greengenes OTU 數據庫 實現。
1. 5 反應器氣體產生的分析
于固定時間每6 d 測定一次格室內產生氣體中氫氣和甲烷的含量,檢測方法為氣相色譜法。使用儀器為安捷倫7820A 氣相色譜儀,檢測器為TCD,色譜柱為TDX-01,色譜條件如下:進樣口、色譜柱、檢測器的溫度分別為100、100 和200 ℃ ;載氣為氮氣,流量為35 mL?min - 1 ;進樣量為1 mL。
2 結果和分析
2. 1 四環素對反應器內氣體產生的影響
ABR 3 個格室中氫氣的產生情況如圖2 所示。僅在格室1 中檢測到氫氣的存在,而格室2 和格室3中沒有檢測到氫氣的產生,這主要是由于格室1 進行的是產氫產乙酸反應,而后端格室主要進行的是產甲烷反應。未添加四環素運行時,格室1 內氫氣的平均產量為0. 010 2 L? - 1 。添加四環素后,氫氣產量是未添加四環素時氫氣產量平均值的
4. 05 ~
6. 89 倍。說明四環素的添加能使氫氣產量增加。
ABR 3 個格室甲烷產生情況,如圖3 所示。在未添加四環素時,格室1、格室2、格室3 的甲烷平均產量分別為0. 320
4、0. 146
2、0. 088 1 L? - 1。顯然,甲烷產量在縱向上呈降低的趨勢。這與反應器內的底物分配有關,格室1 進水有機物含量較高,隨著格室內微生物的降解作用,有機物含量在縱向上隨著格室逐漸降低,有機物的減少使得甲烷產量在格室間縱向減小。添加四環素后,格室1、格室2、格室3 的甲烷產量隨著運行時間的推移呈現不同程度的下降,分別是未添加四環素時對應甲烷平均產量的4
3. 90% ~ 80. 20% 、
2
7. 18%~ 7
9. 79% 、3
8. 24% ~ 8
3. 70% 。通過對比四環素添加后同一個格室不同時間的甲烷產量變化,發現甲烷產量隨著運行時間的推移呈現下降趨勢（trend),說明四環素對產甲烷的抑制作用隨著時間的推移增大。
2. 2 微生物(Micro-Organism)豐度分析
通過反應器中獲取的DNA 序列與GreengenesOTU 數據庫進行比對,得出反應器中微生物主要有16 個屬,如圖4 所示。分別為甲烷桿菌屬、密螺旋體屬、寡養單胞菌屬、不動桿菌屬、脫硫弧菌屬、長繩菌屬、叢毛單胞菌屬、互營桿菌屬、梭菌屬、浮霉狀菌屬、Blvii28、Paludibacte
R、AUTHM297、WCHB1-05、A17、W22。
由圖4 可知,隨著四環素的添加,不同物種呈現出不同的變化趨勢。其中,隨著四環素的添加,密螺旋體屬、脫硫弧菌屬、互營桿菌屬、W22 的豐度在3 個格室內均呈現增長的趨勢,說明密螺旋體屬、互營桿菌屬、脫硫弧菌屬、W22 對四環素具有一定耐藥性。
密螺旋體屬能利用氫氣和二氧化碳(C)轉化成乙酸。膜生物反應器膜分離技術與生物處理技術有機結合之新型態廢水處理系統。以膜組件取代傳統生物處理技術末端二沉池，在生物反應器中保持高活性污泥濃度，提高生物處理有機負荷，從而減少污水處理設施占地面積，并通過保持低污泥負荷減少剩余污泥量。主要利用沉浸于好氧生物池內之膜分離設備截留槽內的活性污泥與大分子有機物。膜生物反應器系統內活性污泥（MLSS）濃度可提升至8000~10,000mg/L，甚至更高；污泥齡(SRT)可延長至30天以上。添加四環素后,如表1 所示,格室1、格室2、格室3 內的密螺旋體屬分別是未添加四環素時相應密螺旋體屬平均豐度的
1. 09 ~
2. 00 倍、
1. 27 ~
1. 79 倍、
1. 41 ~
6. 52 倍,密螺旋體屬豐度的增加說明四環素的添加能促進氫氣和二氧化碳轉化成乙酸的過程,有利于乙酸的積累。有研究表明,乙酸是微生物燃料電池生產電能的首選底物,1 t 生物質可產出價值150 美元的乙酸,卻只能產出31 美元的甲烷;因此,在處理四環素污水時,可以充分利用密螺旋體屬的優勢,增加乙酸積累,可以通過耦合系統將乙酸轉化為微生物燃料電池能源或作為發酵工業的原料,實現資源回收。
互營桿菌屬是一類產氫產乙酸細菌,能將高級脂肪酸和醇類氧化分解為乙酸和H2 。
添加四環素后,如表1 所示,除了格室1 第18 天和格室3 第54 天的互營桿菌（fungus)屬比未添加四環素時平均豐度低,這可能（maybe)是由于反應器運行過程中其他條件擾動引起的,其他時間內格室1、格室2、格室3 內的互營桿菌屬分別是未添加四環素時相應互營桿菌屬平均豐度的
1. 37 ~
2. 04 倍、
1. 00 ~
3. 95 倍、
1. 48 ~
2. 98 倍,互營桿菌屬豐度的增加說明四環素的添加有利于產氫過程,與
2. 1 中氫氣產量增大的結論相印證。氫氣是一種清潔能源,具有燃燒熱值高、燃燒產物無污染的特點,具有很好的應用價值;因此,在處理四環素污水時,可以加強氫氣的回收利用,減小污水處理成本。
脫硫弧菌屬是一類硫酸鹽還原菌,它能利用金屬表面的有機物作為碳源,將硫酸鹽還原成硫化氫,加速金屬管材的腐蝕。添加四環素后,如表1 所示,格室1、格室2、格室3 內的脫硫弧菌屬分別是未添加四環素時相應脫硫弧菌屬平均豐度的
1. 09 ~
3. 99 倍、
1. 12 ~
3. 59 倍、
1. 20 ~
7. 40 倍,脫硫弧菌屬豐度的增加說明四環素的出現會加劇污水處理系統中金屬管材的腐蝕;因此,在處理四環素污水時,應充分重視處理系統中金屬管材的防腐措施,減少因脫硫弧菌屬增多而造成的損失。
格室1 內的寡養單胞菌（fungus)屬和不動桿菌屬、格室3 內的梭菌屬和甲烷桿菌屬隨著四環素的添加,豐度先減小后增加,如表2 所示,在四環素添加初期,這些微生物物種在相應格室內受到的抑制作用較大,隨著時間的推移,所受抑制作用減弱,耐藥性增加,說明四環素的長期污染能使微生物的耐藥性發生改變。
表1 豐度隨四環素添加而增大的物種的豐度變化值
表2 豐度隨四環素添加先減小后增大的物種的豐度變化值
2. 3 樣本的主坐標分析(Analyse) 和聚類分析
主坐標分析能展示各個樣本間的差異大小,2 個樣本在坐標軸上的距離較近,則表示這2 個樣本的物種組成較相似。膜生物反應器膜分離技術與生物處理技術有機結合之新型態廢水處理系統。以膜組件取代傳統生物處理技術末端二沉池，在生物反應器中保持高活性污泥濃度，提高生物處理有機負荷，從而減少污水處理設施占地面積，并通過保持低污泥負荷減少剩余污泥量。主要利用沉浸于好氧生物池內之膜分離設備截留槽內的活性污泥與大分子有機物。膜生物反應器系統內活性污泥（MLSS）濃度可提升至8000~10,000mg/L，甚至更高；污泥齡(SRT)可延長至30天以上。圖5 反映了未添加四環素時和添加四環素后樣本間物種的差異大小?？梢钥闯?主成分1 和主成分2 是造成樣品的2 個最大差異特征,貢獻率分別為
2
5. 82% 和
11. 86% 。未添加四環素時,C1、C2、C3 的樣本分別聚在一起,C1 和C2 樣本之間距離較近,且和C3 距離較遠,說明未添加四環素時,C1 和C2 的物種相似性較高,且這2 個格室的物種和C3 格室物種有一定差異。添加四環素后,C1 和C3 物種在初期有個漸變的過程,后期3 個格室的樣本聚在一起,且與未添加四環素時有一定距離,說明四環素添加前后格室內物種有較大差異,且隨著四環素的添加,3 個格室間的物種組成相似性提高。
樣品聚類分析圖 進一步說明PCoA 的結果,樣品越靠近,枝長越短,說明2 個樣品的物種組成越相似。由圖6 可以看出,未添加四環素時,C1 和C2 格室樣品距離較近,枝長較短,說明這2 個格室間物種相似性較高,而C3 格室的樣品在另一個分支上,距離較遠,枝長較長,說明C3 格室的物種與C1、C2 格室的物種具有一定的差異。隨著四環素的添加,C1 和C3 樣本在初期有個遠離的過程,說明物種有個漸變的過程,在后期3 個格室的樣本距離縮短,相互間枝長變短,說明在后期3 個格室物種相似性增大,且添加四環素后的3 個格室樣本與未添加四環素時的樣本分別位于不同的大分支上,說明四環素的添加使反應器內微生物(Micro-Organism)產生較大變化。
主坐標分析 和樣品聚類分析共同說明了四環素添加前后反應器內的微生物(Micro-Organism)的物種組成具有較大差異,四環素添加后,隨著運行時間的推移,格室間微生物的物種組成相似性增大。產生這種現象主要原因是:由于四環素耐藥物種的存在,使四環素添加后不具有四環素耐藥性的物種逐漸被四環素耐藥物種取代,隨著運行時間的推移,各格室內耐藥物種增多,所以格室間物種相似性增大;由于耐藥物種逐漸取代了不耐藥物種,所以四環素添加前后反應器內微生物物種組成有較大差異。說明長期受抗生素污染的污水處理系統對微生物具有選擇性,使微生物群落結構發生變化,進一步說明通過污泥馴化能減小抗生素對污水處理系統的不利影響。具體參見污水寶商城資料或
3 結論
本實驗采用實驗室人工配置污水,對具有3 個格室的ABR 進行連續流實驗,啟動反應器達到穩定狀態后, 分別在無四環素配置污水和濃度為250μg?L - 1 的四環配置污水環境下運行反應器90 d,探討2 種條件下氫氣、甲烷產量的變化,并運用Illumina MiSeq 高通量測序方法從微觀上揭示上述變化的原因。膜生物反應器在污水處理，水資源再利用領域，MBR又稱膜生物反應器（Membrane Bio-Reactor ）,是一種由膜分離單元與生物處理單元相結合的新型水處理技術。主要研究結果如下:1) 四環素的添加能使氫氣產量增加,四環素對產甲烷的抑制作用隨著時間的推移增大;2)Illumina MiSeq 測序獲得反應器內的序列所屬16 個屬,其中,密螺旋體屬、脫硫弧菌屬、互營桿菌屬、W22 對四環素具有一定耐藥性;3)格室1 內的寡養單胞菌屬和不動桿菌屬、格室3 內的梭菌屬和甲烷桿菌屬對四環素的耐藥性隨著四環素污染時間的推移,耐藥性增加,說明四環素長期的污染能引起微生物的耐藥性發生改變;在處理(chǔ lǐ)四環素污水時,可以通過以下調控趨利避害:充分利用密螺旋體屬的優勢,增加乙酸積累,可以通過耦合系統將乙酸轉化為微生物燃料電池能源或作為發酵工業的原料,實現資源回收,在處理四環素污水時,可以加強氫氣的回收利用,減小污水處理成本;硫弧菌屬增多會加劇污水處理系統中金屬管材的腐蝕,因此應充分重視處理系統中金屬管材的防腐措施,減少因脫硫弧菌屬增多而造成的損失;4)PCoA 分析和聚類分析結果表明,四環素添加前后系統內物種組成具有較大差異,四環素的添加引起了具有四環素耐藥性物種逐漸取代不具
