厭氧氨氧化作為一種新型脫氮工藝近年來逐漸引起關注, 其原理為厭氧氨氧化菌利用NO2--N作為電子受體將氨氮氧化為氮氣(Nitrogen).如何高效穩定地獲得NO2--N是Anammox工藝成敗的關鍵.在以往的實驗研究中, NO2--N的獲得主要通過短程硝化來實現, 這一過程通常需要較高的溫度或較低的溶解氧, 且該過程不穩定易變成全程硝化.因此, 通過控制（control)反硝化反應條件, 將NO3--N僅還原至NO2--N, 成為獲得厭氧氨氧化所需NO2--N的一種新的途徑.
研究結果表明, 反硝化反應是在硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶的作用下, 逐級將NO3--N還原為N2的過程).
然而并非所有的反硝化菌都可進行完整的反硝化反應, 部分反硝化菌只能完成反硝化反應鏈中的一個或多個步驟, 這些微生物(Micro-Organism)在反硝化反應鏈上所承擔的角色取決于其所擁有的反硝化還原酶的種類和數量.如在活性污泥中常見的假單胞菌, 它同時具有反硝化呼吸鏈中的全部反硝化還原酶, 可將NO3--N還原為N2, 而埃希氏大腸桿菌及反硝化古菌僅含有硝酸還原酶, 只能將NO3--N還原為NO2--N.通過改變反應條件, 富集僅含有硝酸還原酶的反硝化菌, 即可實現亞硝氮的積累.
圖 1兩種反硝化路徑的示意圖
碳源種類和碳氮比也是影響反硝化過程中NO2--N積累的重要因素.研究表明反硝化反應以乙酸鈉作為碳源時具有最大比反硝化速率, 且存在NO2--N積累現象.當碳源不足時, NO2--N會出現明顯積累, 且積累量隨碳源增加而增加.
本研究以城市污水處理廠營養物去除系統中的活性污泥為對象, 乙酸鈉(Sodium)為碳(C)源, 在不同的C/N下, 通過控制反應時間, 將反硝化過程控制在NO3--N還原為NO2--N這一步驟, 以達到為厭氧氨氧化反應提供NO2--N的目的.同時通過對比不同C/N下NO2--N積累率, 探究實現NO2--N穩定積累的最佳C/N, 為現有反硝化系統組成理論提供依據.
2 材料(Material)與方法2.1 接種污泥及富集培養方法
實驗在3個平行的SBR反應器中進行, 進水C/N分別為1、2.5和4.反應器容積均為1 L, 初始污泥濃度為1000 mg?L-1, HRT為12 h, SRT為8 d, 反應溫度為25~27 ℃.接種污泥取自西安市第四污水處理廠A/A/O生物反應池中好氧區末端.
試驗期間, 通過不斷縮短反應時間, 達到將NO3--N僅還原至NO2--N的目的.具體操作方式為:進水結束后, 監測反應器內的亞硝酸鹽濃度, 當其濃度達到最大值時, 強制沉淀排水, 終止反應, 此后, 反應器處于閑置狀態, 等待下一個循環.之后維持該反應時間不變, 待NO2--N積累率降低時, 再次縮短反應時間, 以此往復.
2.2 實驗用水
實驗用水采用自來水人工配制, 進水NO3--N濃度均為50 mg?L-1, 乙酸鈉分別按照C/N=1、2.5和4添加, 同時加入氯化銨和磷酸二氫(Hydrogen)鉀補充微生物增長所需氮磷, 并通過NaHCO3調節pH, 保持混合液的pH為7.0~8.0.
2.3 批次試驗
反硝化活性測定
定期測定不同C/N下反硝化過程中NOx--N的濃度變化, 以此考察活性污泥的反硝化活性.具體操作方式方法為:反應周期結束時從不同C/N反應器中各取200 mL活性污泥, 經洗淘后分別置于3個400 mL廣口瓶中, 用氮氣吹脫5 min后加入基質, 并按照C/N=1、2.5和4分別添加乙酸鈉, 密閉后放入25 ℃恒溫水浴振蕩器中進行培養.反應過程中每間隔5 min定時取樣, 分析測定樣品中的NO3--
N、NO2--
N、COD等指標.
碳(C)源包含比重對反硝化活性影響
為了探究碳源含量對反硝化過程中NO2--N積累的影響, 設計實驗:取C/N=2.5反應器中的污泥進行反硝化反應, 在NO2--N積累量達到最大時停止反應, 之后繼續添加足量COD, 整個反應過程中定時取樣, 取樣結束后立即分析測定水樣的NO3--
N、NO2--
N、COD等指標.
2.4 分析項目與方法
各項指標測定方法均為標準方法, 其中NO3--N采用紫外分光光度法; NO2--N采用乙二胺分光光度法; COD采用重鉻酸鉀(Potassium)滴定法; NH4+-N采用納氏試劑分光光度法; pH采用玻璃電極法.由于NO2--N的存在會影響COD的測定, 因此, 對測定COD進行校正: COD校正= COD實測-1.14CNO2--N.
2.5 反硝化速率及轉化效率計算
通過活性試驗測定反硝化過程中NOx--N的濃度變化及污泥濃度, 根據式~ 計算反硝化速率及轉化效率.
NO3--N還原速率:
NO2--N積累速率:
NO3--N轉化率:
NO2--N積累率:
式中, μNO3--N為NO3--N還原速率; μNO2--N為NO2--N積累速率; ΔCNO3--N為單位時間還原的NO3--N量; ΔCNO2--N為單位時間積累的NO2--N量; X為污泥濃度; 50為進水NO3--N濃度50 mg?L-1.
2.6 高通量宏基因組微生物測序
從反應器中取一定量活性污泥, 經去離子水淘洗, 離心后按照OMEGA試劑盒E.Z.N.自動取款機 Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒使用說明, 在MyiQ Real-time PCR擴增儀上進行PCR反應.擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后, 利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒 對DNA進行精確定量, 以質量比
1:1等量混合后上機測序.
3 結果與討論3.1 反應器運行情況特征
在不同的C/N值下, 通過控制反硝化反應時間, 在SBR反應器中經過108 d的培養后, 實現了NO2--N的穩定積累.圖 2為各個反應器出水NOx--
N、NO2--N積累率、NO3--N轉化率及污泥濃度與反應時間的歷時變化.由圖可知, 在C/N=1和C/N=2.5的反應器中, 隨著反應時間的減少, 出水NO3--N濃度逐漸降低, NO3--N轉化率和NO2--N積累率均逐漸增大, 這一結果表明被還原的NO2--N并未繼續參與后續反應, 實現了穩定積累; 而在C/N=4的反應器中, 隨著反應時間的縮短, NO3--N轉化率逐漸增大, 出水NO2--N濃度和NO2--N積累率先增大后減小.這是由于在培養后期, 反硝化菌活性增大, NO2--N快速積累, 反硝化菌利用剩余COD將部分積累的NO2--N繼續還原成N2, 從而導致出水NO2--N濃度和NO2--N積累率下降.
圖 2各個反應器出水NOx--
N、積累率、轉化率及污泥濃度與反應時間的歷時變化
富集培養過程中, 在培養初期由于污泥處于馴化期, 排泥量大于污泥增長量, 導致污泥濃度持續降低, 隨著培養過程的進行, 污泥活性增大, 每天排泥量約等于污泥增長量, 污泥濃度恒定在1.1 g?L-1.
3.2 污泥的活性變化
培養過程中, 通過定時測定NO3--N最大還原速率和NO2--N最大積累速率來表征反硝化活性, 結果見圖 3.當碳氮比為1、2.5和4時NO3--N最大還原速率和NO2--N最大積累速率分別為300.73和300.15、417.29和402.01、426.73和420.86 mg?g-1?h-1.隨著培養時間的增長, NO3--N最大還原速率和NO2--N最大積累速率均逐漸增大并達到穩定狀態, 且兩者之間的差值也逐漸減小, 表明還原的NO3--N幾乎全部轉化為NO2--N并實現穩定積累.
圖 3不同C/N下反硝化速率變化情況
同時碳氮比對反硝化活性也有較大影響.隨著碳氮比的增大, 反硝化活性也逐漸增大.不同C/N下的反硝化活性試驗結果如圖 4所示.當C/N為1和2.5時, 反硝化過程實現了穩定的NO2--N積累, COD在NO2--N積累量達到峰值時基本被完全消耗, 且NO2--N積累量隨著C/N值的增大而增大:當C/N=1時, NO2--N最大積累量為20 mg?L-1, 平均積累率為88%;C/N=2.5時, NO2--N最大積累量為40 mg?L-1, 平均積累率為95%;當C/N=4時, NO2--N達到最大積累量后繼續反應還原為N2, 至反應結束時, NO2--N積累率僅為65%, 而COD在NO2--N最大積累量處時仍剩余70 mg?L-1.分析以上實驗結果可知, 較低的C/N有利于實現NO2--N的穩定積累, 這是由于在反應過程中基質的限制導致NO2--N無法繼續還原為N2.
圖 4不同C/N值下NOx--N和COD變化
3.3 碳源含量對反硝化過程中亞硝氮積累的影響
碳源含量對反硝化過程中亞硝氮積累的影響的實驗結果如圖 5所示.在反應開始20 min內, 由于碳源充足, 反硝化菌活性最大, NO3--N最大還原速率為417.25 mg?g-1?h-1, NO2--N最大積累速率為409.38 mg?g-1?h-1; 反應20~60 min時, 由于基質限制, 反硝化菌活性下降, NO3--N還原速率和NO2--N積累速率均逐漸降低（reduce), 分別為92.12 mg?g-1?h-1和52.68 mg?g-1?h-1, 在60 min時NO2--N積累量達到最大; 60 min后碳源耗盡, 反硝化菌利用內源呼吸緩慢還原NO2--N, 最大還原速率僅為23.23 mg?g-1?h-1.隨后加入足量COD, 反硝化菌將積累的NO2--N還原為N2, 最大還原速率為65.68 mg?g-1?h-1.
圖 5碳源含量對反硝化過程的影響
在碳源充足和硝酸鹽含量較高的條件下, NO3--N還原速率和NO2--N積累速率基本相同.在此期間, NO3--N還原量為35.53 mg, NO2--N積累量為32.81 mg, 消耗COD量為92.79 mg, 對應的NH4+-N消耗量為3.27 mg; 其中NO3--N還原消耗COD量比重為1.12 g?g-1, 根據NH4+-N消耗量計算合成細胞消耗COD量為49.29 mg, 剩余3.7 mg COD被用于還原部分NO2--N, 1 g NO2--N被還原至N2理論上需要消耗1.72 g COD.由上可知除細胞合成外, COD大部分用于還原NO3--N, 僅有少量COD被用于還原NO2--N.此時, 電子受體NO3--N和NO2--N相互競爭, 反硝化菌（fungus)利用碳源將NO3--N僅還原至NO2--N, 還原的NO2--N幾乎全部積累.由于反硝化酶合成順序中硝酸還原酶早于亞硝酸還原酶的合成, 并且NO3--N還原比NO2--N的還原釋放更多的自由能, 導致了NO3--N存在會抑制NO2--N的還原, 所以反應初期NO2--N的還原速率和內源呼吸時還原速率基本相同, 從而導致NO2--N的積累.
而當碳源不足時, 基質的限制導致NO2--N積累, 同時反硝化菌的亞硝酸還原酶活性逐漸恢復.當向系統補充了足量的COD后, NiR活性增大, 促使積累的NO2--N被迅速還原, 但此時NO2--N的最大還原速率仍遠遠低于初始NO3--N還原速率, 這可能是由于在培養過程中, 部分反硝化菌中的NaR含量增加, NiR含量降低, 使NO3--N優先還原, 從而出現了上述情況(Condition).
3.4 微生物種群組成
本研究中培養污泥中的優勢菌群為Thauera屬, 屬于β-Proteobacteria綱, 除此之外活性污泥中還存在Dechloromonas屬、Flavobacterium屬和Bdellovibrio屬等微生物, 培養污泥種群結構組成見圖 6.
圖 6培養污泥種群結構組成
Thauera和Flavobacterium僅能將NO3--N還原為NO2--N, 從而導致反硝化系統中NO2--N積累.一般認為Thauera屬中大部分種僅含有氨氮水(Nitric acid)鹽還原酶, 即在厭氧環境下僅將NO3--N還原為NO2--N; 而最新的研究表明Thauera屬中部分種同時存在其它的反硝化酶, 但當NO3--N存在時, 微生物無法合成亞硝酸鹽還原酶, 這也是本研究采用了較短的反應時間, 當硝酸鹽消耗殆盡時, 即停止反應, 從而獲得最大的NO2--N積累和Thauera屬微生物的富集. Flavobacterium具有與Thauera相同的特性.而當NO3--N被完全還原后, 此時, 如果繼續反應, Thauera和Flavobacterium的亞硝酸鹽還原酶活性將逐漸恢復, 將NO2--N繼續還原至NO, N2O或N2, 且此時NO2--N的最大還原速率低于初始NO3--N的還原速率.
除此之外, 培養污泥中還含有少量Dechloromonas和Bdellovibrio, 兩者為常見反硝化菌, 含有反硝化過程全部酶系, 可將NO3--N還原為N2.這些菌屬的存在也是導致本研究（research)中仍有部分積累NO2--N被還原為N2的原因.具體參見污水寶商城資料或
4 結論
1) 通過控制反應時間和碳源供給, 將反硝化過程控制在NO3--N還原為NO2--N這一步驟, 實現NO2--N的穩定積累.
2) 在碳氮比為2.5時, 經108 d的培養, 反硝化反應時間從60 min縮短至20 min, NO3--N還原速率和NO2--N積累速率分別為0.417 g?g-1?h-1和0.402 g?g-1?h-1, NO2--N最大積累率達到95%.
3) 反硝化活性隨著碳氮比的增大而增大, 而較低的C/N更有利于實現穩定的NO2--N積累.
4) 在反硝化亞硝氮積累的過程中, 當碳(C)源充足時, NO3--N和NO2--N同時作為電子受體互相競爭碳源, NO3--N的存在會抑制NO2--N的還原, 從而導致(cause)NO2--N積累; 而當碳源不足時, 基質的限制使得NO3--N優先還原, 導致NO2--N的積累.
5) 培養污泥中的優勢菌群為Thauera, 該菌僅能將NO3--N還原為NO2--N, 從而導致NO2--N的積累.
